Система eINTACT анализирует использование бактериями осмосигналов растений для повышения вирулентности.

Природные растения, том 9, страницы 128–141 (2023 г.) Процитировать эту статью

4314 Доступов

43 Альтметрика

Подробности о метриках

Бактерии вводят эффекторные белки в клетки-хозяева, чтобы манипулировать клеточными процессами, которые способствуют заболеванию. Поскольку бактерии доставляют незначительные количества эффекторов только в целевые клетки-хозяева, технически сложно уловить эффекторно-зависимые клеточные изменения в массово инфицированных тканях хозяина. Здесь мы сообщаем о новом методе, называемом эффекторно-индуцируемой изоляцией ядер, меченных в определенных типах клеток (eINTACT), который облегчает аффинную очистку ядер из растительных клеток Arabidopsis, которые получили бактериальные эффекторы Xanthomonas. Анализ очищенных ядер показывает, что эффектор Xanthomonas XopD манипулирует экспрессией генов, связанных с передачей сигналов абсцизовой кислоты Arabidopsis, и активирует OSCA1.1, ген, кодирующий проницаемый для кальция канал, необходимый для закрытия устьиц в ответ на осмотический стресс. Потеря OSCA1.1 вызывает увядание листьев и снижение роста бактерий в зараженных листьях, что позволяет предположить, что OSCA1.1 способствует восприимчивости хозяина. eINTACT позволяет нам обнаружить, что XopD использует осмосигнализированное закрытие устьиц хозяина OSCA1.1/абсцизовой кислоты для создания влажной среды обитания, способствующей росту бактерий, и открывает новый путь для точного выяснения функций эффекторов многочисленных грамотрицательных растительных бактерий в нативных микроорганизмах. контексты заражения.

Бактериальные патогены проникают в растения-хозяева через естественные отверстия (например, устьица или гидатоды) или раны и впоследствии размножаются в апопластном пространстве между клетками или в сосудах1,2. Чтобы облегчить инфекцию, вирулентные грамотрицательные бактерии вводят эффекторы в клетки-хозяева, используя шприцоподобный мультипротеиновый комплекс, систему секреции III типа (T3SS)3. Внутри клеток-хозяев эффекторы локализуются в определенных субклеточных компартментах и манипулируют клеточными процессами хозяина, чтобы подавить иммунитет хозяина и/или создать среду, благоприятствующую росту или распространению бактерий4,5. Недавние исследования бактериальных патогенов показывают, что создание водного апопластного пространства у растений имеет решающее значение для вирулентности бактерий6. Действительно, было идентифицировано несколько эффекторов, которые способствуют заболеванию, вызывая повышение уровня воды в инфицированных тканях, например, Pseudomonas syringae HopM16, Xanthomonas gardneri AvrHah17 и Xanthomonas translucens Tal88. Из-за разнообразия эффекторов в филогенетически различных бактериальных родах молекулярные механизмы, лежащие в основе эффекторно-опосредованной восприимчивости растений, остаются во многом загадочными.

Xanthomonas Campestris pv. Campestris штамм 8004 (Xcc8004) представляет собой сосудистый патоген листьев, вызывающий черную гниль у многих культур Brassica и модельного растения Arabidopsis2. Один из его эффекторных белков, внешний белок D Xanthomonas (XopDXcc8004, в этом исследовании XopD), представляет собой локализованный в ядре эффекторный белок типа III, содержащий три N-концевых специфичных для растений этилен-чувствительных элементов, связанных с амфифильной репрессией (EAR). мотивы, которые обычно опосредуют транскрипционное молчание в planta и C-концевой домен цистеиновой протеазы9 (расширенные данные, рис. 1). Интересно, что в двух предыдущих исследованиях сообщалось о различной активности XopD у Arabidopsis10,11. Одно исследование показало, что XopD способствует заболеванию, подавляя ранний некроз листьев, но не влияет на рост бактерий в инфицированных листьях арабидопсиса10. Через свой домен, содержащий мотив EAR, XopD взаимодействует и стабилизирует белки DELLA Arabidopsis, которые являются основными репрессорами транскрипции генов, чувствительных к гиббереллиновой кислоте (GA)10. Тем не менее, взаимодействие XopD-DELLA не вызывает заметных изменений в уровнях GA-чувствительных транскриптов10. Спорно, что другое исследование выявило авирулентный эффект XopD, поскольку трансгенная экспрессия XopD под контролем индуцируемого β-эстрадиолом промотора у Arabidopsis запускала зависимые от салициловой кислоты (SA) защитные реакции и подавляла рост бактерий11. Кроме того, было обнаружено, что XopD, обладая небольшой протеазной активностью убиквитин-подобного модификатора (SUMO), взаимодействует in vitro с HFR1 Arabidopsis и деSUMOилирует его, транскрипционный фактор (TF), участвующий в передаче сигналов фитохрома11. В совокупности оба предыдущих исследования позволяют предположить, что XopD может модулировать активность растительных ТФ и сигнальных путей фитогормонов хозяина. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе точных функций XopD in planta, остаются неубедительными.

2) enriched biological GO terms. The DEGs that were not annotated by these GO terms were not shown. c, WashU Epigenome Browser snapshots showing mCG and mCHH methylation levels at SUVH9 and OSCA1.1 loci. Positive and negative bars indicate 5-methylcytosine levels of single cytosine on the Watson (+1) and Crick (−1) strands, respectively. The transposable elements (TEs) are shown as grey boxes. The transcription start site (TSS) is indicated with a brown triangle. d,e, The expression levels (mean read counts) of OSCA1.1 (d) and PR1, PR2, PR5, EDS1 and PAD4 (e) in nuc−XopD and nuc+XopD. Data are presented as mean values ± s.e.m. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. DESeq2 P values are from Wald test corrected for multiple testing using the Benjamini–Hochberg method (nuc−XopD versus nuc+XopD; OSCA1.1, P = 0.033; PR1, P = 0.819; PR2, P = 0.947; PR5, P = 0.794; EDS1, P = 0.833; PAD4, P = 0.981). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). f, Relative expression of XopD, PR1, PR2, OSCA1.1 and HYL1 after XopD was induced by β-estradiol in Arabidopsis seedlings, relative to their expression in DMSO-treated seedlings. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.e.d. (error bars) from n = 2 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (DMSO-treated seedlings versus β-estradiol-treated seedlings; XopD, P = 0.04; PR1, P = 0.04; PR2, P = 0.03; OSCA1.1, P = 0.42; HYL1, P = 0.15). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). Small circles indicate data points of individual biological replicates (d–f)./p> 0.05). b, RT-qPCR analysis of RD29A expression in nuc+XopD relative to its expression in nuc−XopD. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (P = 0.043). *P < 0.05. c, Relative abundances of miR159a in nuc−XopD and nuc+XopD compared to its abundance in total nuclei of mock-inoculated leaves. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates and normalized against the abundances of ACTIN2/8 in each sample. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (nuc−XopD versus nuc+XopD, P = 0.019). *P < 0.05. d, Representative leaves infected with indicated bacterial strains under regular (60%) or high (95%) humidity conditions at seven DPI. Mock, treatment with buffer; ABA, treatment with ABA. e, The water loss rate of detached Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) infected leaves at seven DPI. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 8 leaves from four different plants. f, A boxplot representing bacterial population density in symptomatic leaf tissues inoculated with Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) at seven DPI. Horizontal lines from the top show maxima, upper quartile, median, lower quartile and minima values, and cross marks show the mean values. For each treatment, n = 8 leaves from four different plants were examined. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (no treatment: Xcc∆xopD* inoculated leaves versus Xcc* inoculated leaves, P = 0.046; Xcc∆xopD* inoculated leaves: mock treatment versus ABA treatment, P = 0.014). *P < 0.05. Small circles (a–c,f) represent data points of individual biological replicates./p>six-fold) lower in nuc+XopD (Fig. 4c), which coincided with a significant increase in MYB33 expression in these nuclei (Fig. 4a)./p>

5, false discovery rate (FDR) adjusted P value < 0.05, |log2FC| > 1)47./p>96% methylated pUC19 DNA spiked in) was sheared to 100–500-bp fragments using a focused ultrasonicator (Covaris E220 system), in microtubes at a setting of 175 peak incident power, 10 dc, 200 cpb for 40 s. Enzymatic methyl-sequencing (EM-seq) libraries were prepared from sheared DNA using NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit following the manufacturer instructions (New England BioLabs). Due to the amount of starting DNA material being lower than 10 ng, the minimum recommended amount of starting material by the manufacturer, we added two PCR cycles at the final step of PCR amplification of the sequencing libraries. Libraries were sequenced on NovaSeq 6000 system (Novogene) for collecting 2× 150-bp paired-end reads that passed the Illumina quality control filter (Supplementary Table 8)./p>100 bp, mean methylation difference >0.15, test statistic areaStat >10. A locally installed WashU Epigenome Browser was used for visualizing DNA methylation at single-base resolution54./p>2) sample types were analysed by ANOVA followed by post hoc Tukey’s honestly significant difference. Experiments were performed at least twice with similar results./p>

0.05)./p>

Блог

Система eINTACT анализирует использование бактериями осмосигналов растений для повышения вирулентности.